單克隆抗體制備常見(jiàn)問(wèn)題分析

一、免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

有時(shí)不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。

1、免疫動(dòng)物的種屬及品系是否合適，可考慮改變動(dòng)物的種屬或品系，或擴(kuò)大免疫動(dòng)物的數(shù)量。

2、抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。

3、制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑，載體、抗原或載體的比例、反應(yīng)時(shí)間等多方面去考慮，并加以改進(jìn)。

4、所用的佐劑是否合適，乳化是否*，可改用其它佐劑，或加強(qiáng)乳化。

5、免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。

6、動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。

二、制備單克隆抗體影響因素、失敗原因分析

由于制備McAb的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會(huì)造成失敗。

其主要失敗原因和影響因素有

1、污染

包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中zui辣手的問(wèn)題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來(lái)源于牛血清，此外，其它添加劑、實(shí)驗(yàn)室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實(shí)驗(yàn)室，要對(duì)每一批小牛血清和長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時(shí)采取措施處理。對(duì)于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過(guò)濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待長(zhǎng)出腹水或?qū)嶓w瘤時(shí)，犖^菌取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。

2、融合后雜交瘤不生長(zhǎng)

在保證融合技術(shù)沒(méi)有問(wèn)題的前提下主要考慮下列因素

（1）PEG有毒性或作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

（2）牛血清的質(zhì)量太差，用前沒(méi)有進(jìn)行嚴(yán)格的篩選。

（3）骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體。

（4）HAT有問(wèn)題，主要是A含量過(guò)高或HT含量不足。

3、雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體

（1）融合后有細(xì)胞生長(zhǎng)，但無(wú)抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。

（2）有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

（3）對(duì)于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮?，可能是?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長(zhǎng)。也可能發(fā)生染色體丟失。Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

三要：

要大量保持和補(bǔ)充液氮凍存的細(xì)胞原管。

要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

要定期進(jìn)行再克隆。

三不要：

不要讓細(xì)胞“過(guò)度生長(zhǎng)”。因?yàn)榉欠置诘碾s交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢(shì)，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個(gè)月。

不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機(jī)體內(nèi)以腫瘤生長(zhǎng)形式連續(xù)傳好幾代。

4、雜交瘤細(xì)胞難以克隆化

可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。